Isolation and identification of human metabolites from a novel anti-tumor candidate drug 5-chlorogenic acid injection by HPLC-HRMS_MSn and HPLC-SPE-NMR
这篇论文研究了新型抗肿瘤候选药物5-绿原酸（5-CQA）注射液在人体内的代谢产物。
人体肌肉注射注射用绿原酸后，尿液鉴定程序
研究背景
1、5-CQA注射液是一种新型的抗肿瘤候选药物，目前正在中国进行临床试验（I期）。然而，关于其在人体内的代谢产物尚不明确。
2、研究药物代谢产物的难点在于代谢产物的多样性和复杂性，尤其是在复杂的生物样本中分离和鉴定这些代谢产物。
3、已有研究表明，5-CQA具有多种药理活性，包括抗菌、抗氧化、镇痛、解热和抗癌作用。然而，关于5-CQA在人体内的代谢产物研究较少，特别是在肌肉注射后的代谢情况。
研究方法
1、使用高效液相色谱-高分辨质谱（HPLC-HRMS/MS^n）和高效液相色谱-固相萃取-核磁共振（HPLC-SPE-NMR）技术分析了健康成人肌肉注射5-CQA注射液后的尿液和粪便样本。
2、样品制备包括尿样和粪样的收集与处理。尿样在第一天分三段（0-3小时、3-4小时和4-6小时）收集，第二天到第五天收集0-3小时的尿样。粪样在给药后第一天0-24小时内收集。
4、HPLC-HRMS/MS^n分析条件包括使用Waters Symmetry C18柱（250 mm × 4.6 mm, 3 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液和甲醇，流速为0.9 mL/min，使用负离子模式进行检测。
5、HPLC-SPE-NMR分析条件包括使用Agilent 1260系统，分离模式为梯度洗脱，使用Hysphere GP-phase SPE柱进行目标化合物的富集。
实验设计
1、在尿液样本中，共鉴定出六种代谢产物，包括异构化的5-CQA（P1和P2）、水解的5-CQA（M1和M2）和甲基化的5-CQA（M3和M4）。其中，M3和M4是主要的代谢产物。
2、使用HPLC-SPE-NMR技术对M3和M4的结构进行了表征，结果显示M3和M4的甲氧基分别位于C-3′和C-4′。
3、由于没有商业参考品，M3和M4的纯品通过5-CQA甲基化合成并进行分离纯化。合成样品经过HPLC分析和NMR验证，确认其与尿液样本中的M3和M4为同一化合物。
结果与分析
1、通过HPLC-HRMS/MS^n方法，成功鉴定了尿液中的六种代谢产物，并确认M3和M4为主要代谢产物。
2、HPLC-SPE-NMR分析结果显示，M3和M4的甲氧基分别位于C-3′和C-4′，进一步验证了其结构。
3、反向分子对接分析预测了M3和M4对恶性胶质瘤相关靶点的潜在活性，结果显示M3和M4在多个恶性胶质瘤相关通路中具有多种相互作用。
总体结论
1、这是首次阐明5-CQA注射液甲基化代谢产物M3和M4的结构，并支持了临床人体质量平衡研究。
2、研究结果为理解5-CQA注射液在人体内的代谢提供了新的见解，并为其临床应用提供了支持。
通过这篇论文，研究人员详细研究了5-CQA注射液在人体内的代谢情况，并为进一步的临床研究提供了重要的实验数据和理论支持。