这篇论文研究了绿原酸（Chlorogenic Acid）作为一种双光子荧光探针，在缺氧条件下调节肿瘤细胞糖酵解的特性。

研究背景

1、癌症的标志性特征之一是高水平的稳态线粒体活性氧（ROS）和糖酵解。

2、研究肿瘤能量代谢与线粒体ROS调节之间的相互作用对于开发新的抗癌策略非常重要，但传统的生化方法难以捕捉到癌细胞代谢激活过程中瞬时的亚细胞ROS变化。

3、现有的研究主要集中在通过转录或蛋白质表达水平分析来研究癌细胞中的能量代谢和ROS稳态，但这些方法无法实时、直接地观察活细胞和体内组织中的ROS变化。

研究方法

1、光物理性质评估：绿原酸在体外对超氧阴离子（O₂•-）表现出荧光开启响应。通过紫外-可见光谱和荧光光谱实验，研究了绿原酸在不同浓度O₂•-下的光物理性质。绿原酸在330 nm处有最大吸收峰，加入O₂•-后移至410 nm，荧光强度在480 nm处线性增强。

2、细胞成像实验：使用A375黑色素瘤细胞，预先用2-甲氧基雌二醇（2-ME）处理以诱导氧化应激，绿原酸在活细胞中特异性地积累在线粒体中，并对O₂•-表现出荧光增强响应。通过共聚焦显微镜观察，绿原酸的荧光与MitoTracker Green高度共定位，皮尔逊共定位系数为0.79。

3、细胞活力和集落形成实验：在常氧（20% O₂）和缺氧（1% O₂）条件下，评估不同浓度绿原酸对A375黑色素瘤细胞活力的影响。绿原酸在缺氧条件下表现出显著的抗癌活性，而在常氧条件下则无显著影响。集落形成实验进一步验证了绿原酸在缺氧条件下的抗癌活性。

4、西方印迹分析：在体内和体外实验中，绿原酸处理显著降低了肿瘤组织中AMPKα的磷酸化水平。

实验设计

1、细胞实验：A375黑色素瘤细胞在不同氧浓度下培养，评估绿原酸对其糖酵解表型的影响。使用MTT法测定细胞活力，集落形成实验验证绿原酸的抗癌活性。

2、动物实验：建立A375黑色素瘤细胞的异种移植模型，评估绿原酸在体内的抗癌效果。小鼠分为对照组和不同剂量的绿原酸处理组，监测肿瘤体积和体重变化。

3、生物能量测量：使用Seahorse XF分析仪测定细胞外酸化率（ECAR）、氧消耗率（OCR）和ATP生成，评估绿原酸对癌细胞能量代谢的影响。

结果与分析

1、绿原酸在缺氧条件下显著抑制了肿瘤细胞的糖酵解表型，降低了AMPK的激活，使代谢从糖酵解转向氧化磷酸化（OXPHOS），从而抑制了肿瘤细胞的增殖。

2、在体内实验中，绿原酸有效抑制了肿瘤生长，且对体重无明显影响。绿原酸处理组的肿瘤组织中AMPKα磷酸化水平显著降低。

3、生物能量测量结果显示，绿原酸处理组在缺氧条件下的ECAR和ATP生成显著降低，而OCR显著增加。

总体结论

1、绿原酸作为一种基于咖啡酸的双光子荧光探针，可以实时、灵敏地检测活细胞和组织中的线粒体O₂•-水平。

2、绿原酸通过降低细胞内ROS水平，调节代谢，抑制肿瘤细胞在缺氧条件下的增殖。

3、这些发现为癌症能量代谢中的线粒体O₂•-作用提供了新的见解，并有助于开发新的抗癌策略。

这篇论文展示了绿原酸作为双光子荧光探针在癌症研究和治疗中的潜力，并为未来的研究提供了方向。

文献链接